江苏激光联盟导读：

光学分辨率光声显微镜（OR-PAM）是一种新的混合成像技术，它使我们能够聆听光的声音并看到生物组织本身的颜色。它可以用于实时、多对比度功能成像，但是大多数商业激光器的波长选择有限，并且现有扫描方法的局限性意味着OR-PAM在单次扫描中只能获得一种或两种不同类型的对比度。这些限制使多对比度功能成像变得很耗时，并且很难捕获生物组织中功能信息的动态变化。为了克服这些限制，来自香港城市大学的研究小组开发了基于单个激光源的多波长OR-PAM系统。该研究成果2021年1月4日发表在Advanced Photonics上。

血管和淋巴管的体内成像对于监测生理参数和早期诊断致命疾病很重要。血管和淋巴管是两组循环网络，具有独特但相互依存的功能。淋巴管存在于大多数组织中，并在许多生理过程中发挥重要作用。血液循环可提供氧气和营养，清除废物，并与淋巴循环高度相关。最近的研究表明，血流、局部氧含量和淋巴管是肿瘤生长和转移的重要因素。血液和淋巴管的同时成像在疾病的诊断和治疗中具有重要的价值。现有的大多数生物成像技术是限于低时空分辨率或无法同时成像血管和淋巴管中的多重对比度。迫切需要能够同时对血液和淋巴管成像的高分辨率多对比度成像技术。

最近，已经开发出光学分辨率光声显微镜 (optical-resolution photoacoustic microscopy, OR-PAM) ，用于体内血红蛋白浓度(CHb)、血氧饱和度(sO2) 、血流速度(v)、氧代谢率和淋巴管成像。尽管前景乐观，但受激光源的限制，尚未在OR-PAM中实现血液和淋巴管的同时成像。在单次扫描中，OR-PAM只能量化一个或两个对比度。必须进行重复扫描以绘制多个功能或分子对比，这降低了通量和不同量之间的时间相关性。

在这里，来自香港城市大学的研究人员介绍了五波长OR-PAM，它可以在一次扫描中成像血液和淋巴管。可以对多种对比进行定量，包括血红蛋白浓度，血流量，血氧饱和度和外源性染料。基于受激拉曼散射（SRS）效应，他们开发了五波长（532、545、558、570和620 / 640nm）纳秒脉冲激光。在每个扫描点，依次获取这些波长的5条A线。532 nm波长用于成像血红蛋白浓度。532和545 nm波长用于通过双脉冲方法测量血流速度；532、545、558和570 nm波长用于确定氧饱和度（sO2）；620/640 nm波长用于对染料标记的淋巴管成像。使用五波长OR-PAM系统，研究人员展示了血液和淋巴管在肿瘤生长，淋巴染料清除和脑功能监测中的高分辨率多对比度体内成像。

▲图1. 五波长OR-PAM的示意图

对于每个波长和纳秒波长切换时间，五波长脉冲激光器需要具有足够的脉冲能量。图1显示了激光器和成像探头的示意图。研究人员使用脉冲激光（532 nm波长，VPFL-G-20，Spectra-Physics）通过光纤中的SRS效应泵浦其他波长。石英纤维的拉曼频移为〜13.2THz，对应于532 nm附近的13 nm波长偏移。这五个波长是532、545、558、570和620 / 640nm。五个脉冲在光纤中以不同的光学延迟在时间上分开。样品表面上每个波长的脉冲能量都在90 nJ以上。

光学分辨率光声显微镜OR-PAM

基于目标生物组织的固有吸收特性，光声成像利用了以下事实：当组织被脉冲激光束作为目标时，它会吸收光并产生瞬时热量。该热量引起热膨胀，从而产生机械超声波，称为光声（PA）波。通过超声换能器收集PA波并重建信号后，科学家可以获得一张图像，该图像显示了生物组织中的光吸收分布。光学分辨率的光声显微技术为生物组织的结构，形态，功能和代谢提供高分辨率和高对比度的图像信息，在生物分子成像中具有广泛的应用前景。

五波长光纤激光源

Wang的团队通过开发基于单波长纳秒激光源的五波长光纤激光源，改进了OR-PAM。不同波长之间的切换时间发生在亚微秒级，这为同时进行多功能OR-PAM开辟了可能性。Wang的团队通过测量能量波动和漂移来验证系统稳定性，并测试了成像深度以及OR-PAM成像的横向和轴向分辨率。

Wang表示，该系统基于受激拉曼散射（SRS）效应。基本上，泵浦激光源可以产生散射的激光束，该散射的激光束的波长比通过光纤的原始入射光束的波长长。当泵浦激光源的能量超过某个阈值时，生成的SRS波长将保持高方向性，高单色性和高相干性，这使其非常适合作为OR-PAM的激光源。多个散射波长可用于多对比度光声成像。

多功能成像和疾病建模

Wang的团队还开发了一种多参数图像处理方法，用于计算微血管中的直径、深度、曲折度和其他生理参数，从而为疾病建模提供图像分析基础。使用五波长OR-PAM，研究团队进一步进行了肿瘤发展，淋巴清除和脑部成像的多功能成像。在第一步中，他们对体内的小动物进行了多功能显微成像，包括血红蛋白浓度、血流速度、氧饱和度和淋巴浓度。他们还分析了成像区域中不同血管的形态和功能差异（包括直径、血流量、血氧水平等）。

由于传统的多功能OR-PAM需要多个扫描和多个激光源才能获得此类结果，因此他们的工作解决了两个重要问题。一种是组织中血管的微环境随时间变化，因此多次长期扫描会导致功能成像不一致。另一个是不同激光源之间的异步性。这样的波动会导致系统的计算错误。这种新方法可以在单个激光源和一次扫描中实现多功能成像，这不仅大大缩短了成像时间，而且提高了成像精度。

研究人员展示了该技术在早期癌症检测、监测淋巴循环和对大脑成像中的潜在应用。将来，在620 / 640nm处具有强吸收性的其他分子或纳米探针也可以用作造影剂。可以在一次扫描中获取共同注册的血液动力学、功能和分子信息。这项技术进步使得能够同时在活体内进行多对比度成像，从而提供了一种新的生物医学成像工具。Wang表示将来通过优化扫描方法，并结合多波长OR-PAM，可以实现某些疾病模型中生理参数动态变化的实时成像。

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