江苏激光联盟导读：

数十年来，高分辨率的体内光学深脑成像一直是一个巨大的挑战。一旦与嵌入大脑的梯度折射率（GRIN）透镜集成在一起，双光子内窥镜便提供了一种微创方法来对掩埋的大脑结构进行成像。但是，GRIN透镜的固有像差会损害其成像分辨率和视野。

在过去的几十年中，双光子显微镜技术的发展极大地推动了对神经回路和大脑功能的研究，这是通过在活体大脑中实现高分辨率形态学和功能成像而实现的。结合各种荧光蛋白和指示剂，双光子显微镜可直接观察精细的神经元结构，并在跨越数量级的时空尺度上对动态神经活动进行连续监测。然而，由于组织散射引起的激发和发射光子在深度上的严重衰减，因此成像仅限于浅表脑区域。尽管更长的激发波长或红移荧光标记可以减轻散射效应，但是在小鼠大脑中成像深度仍限于1-2 mm，并且成像质量会随着深度的增加而迅速下降。

为了使更深层的皮层下结构成像超出此限制，在此之前的研究已采用了依靠在大脑中植入微型梯度折射率(gradient refractive index lens, GRIN)透镜的显微内镜。棒状GRIN透镜充当显微镜物镜和样品之间的中继。该透镜已与单光子落射荧光显微镜集成在一起，对位于大脑深处的各种神经元进行成像，这是传统显微镜无法实现的。但是，这种微型单光子显微镜的光学分辨率已被限制在细胞水平上，而图像对比度却由于离焦荧光背景而降低。结合高数值孔径(high–numerical aperture, NA) GRIN透镜的双光子内窥镜检查技术能够以高分辨率解析亚细胞结构。但是，由于GRIN透镜的严重离轴像差，成像视场(field of view, FOV)的直径限制为数十微米。此外，对于三维(3D)成像，由于GRIN透镜已嵌入生物样品中，因此通过改变显微镜物镜与GRIN透镜之间的距离来调整焦平面，这可能导致严重的轴上像差。激发焦点轴向偏离设计的最佳值。因此，由固有像差导致的放大和扭曲的点扩展函数(point spread function, PSF)大大限制了基于GRIN透镜的内窥镜检查的3D成像体积。

AO双光子内窥镜系统用于体内深部脑部成像的示意图。

认识到需要提高成像能力，来自香港科技大学(Hong Kong University of Science and Technology, HKUST)的一组科学家将目光集中在以突触分辨率实现脑成像上。电子与计算机工程学系教授QU Jianan教授与研发副总裁兼晨兴生命科学教授Nancy IP共同努力，成功开发了 一种新的成像技术——自适应双光子显微内镜技术，可以对高分辨率的深部大脑结构进行体内成像。值得注意的是，这项技术可以揭示尚未被深入研究的区域的大脑功能。

在哺乳动物动物模型中对活体大脑进行体内成像的能力对于阐明大脑的功能至关重要。但是，大脑由数百亿个神经元组成，每个神经元都通过突触与成千上万个神经元相连，突触是神经元之间的交流点，可以传递信息。因此，要真正理解神经元突触相互作用的动力学，就需要以高时空分辨率对大脑进行形态学和功能成像的能力。

AO双光子内窥镜可以在较大FOV上以突触分辨率对小鼠海马进行体内成像

该研究团队随后利用自适应光学双光子内窥镜研究海马的神经元可塑性，这是一种关键的深部大脑结构，并揭示了海马内锥体神经元的体细胞和树突活动之间的关系。这项研究2020年9月30日发表在的《Science Advances》杂志上，题目为“Adaptive optics two-photon endomicroscopy enables deep-brain imaging at synaptic resolution over large volumes”。

QU教授表示，这项技术可以对其他深层大脑结构进行成像，例如纹状体，黑质和下丘脑。因此，这是一个令人兴奋的发展，在理解大脑功能和促进大脑深部神经科学研究方面具有巨大潜力。

Nancy IP教授的研究旨在了解阿尔茨海默氏病海马神经元沟通的障碍，他对开发改善海马神经元沟通的方式特别感兴趣。可视化突触所在的树突棘的数量和大小变化的能力将极大地增进人们对记忆障碍期间或用候选治疗药物治疗后神经传递调控的理解。

双光子内窥镜技术的发展意义重大。可以让我们检查海马结构突触的动态变化。与此同时，我们还能够检查海马中不同数量的神经元的放电活动。这将有助于我们了解学习和记忆的分子基础以及在许多神经系统疾病中对记忆功能障碍的放松调节。在他们的研究中，该小组试图使用一种称为GRIN透镜的微型内窥镜对海马神经元进行成像。然而，GRIN透镜的分辨率低并且成像视场受到限制。因此，无法清晰地看到微小的结构，例如树突棘，即从相邻神经元接收信息的神经元突起。这就是自适应光学技术发挥作用的地方。自适应光学技术最初是为地面天文望远镜开发的，目的是补偿大气的光畸变，它采用一颗明亮的恒星或所谓的“导星”来测量大气的光畸变，然后补偿大气中的光畸变。通过使用可变形镜来变形。在开发自适应光学双光子显微镜系统时，香港科大研究团队类似地将局部荧光信号用作生物组织内部的“引导星”，这使他们能够测量内窥镜和脑组织的像差。

体内海马神经元的随机访问多平面Ca2+成像

▲AO成像系统可以清楚地解析紧密堆积的神经元，并准确记录钙瞬变，而不受邻近神经元的干扰。图片来源：HKUST

以高分辨率对深部大脑进行实时成像的能力长期以来一直是一个挑战。借助自适应光学双光子内窥镜，我们现在可以以前所未有的分辨率研究深部大脑的结构和功能，这将极大地促进我们的发展。在了解许多神经退行性疾病的机制和开发相关治疗方面取得了进步。

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本文来源：Zhongya Qin et al, Adaptive optics two-photon endomicroscopy enables deep-brain imaging at synaptic resolution over large volumes, Science Advances (2020). DOI: 10.1126/sciadv.abc6521